Odstavec předpisu 211/2004 Sb.
Vyhláška Ministerstva zemědělství č. 211/2004 Sb., o metodách zkoušení a způsobu odběru a přípravy kontrolních vzorků
Příl.11
Příl.11
Stanovení obsahu kyseliny erukové v olejích a tucích určených
jako takových k lidské spotřebě a v tukové nebo olejové složce
potravin, do kterých byly oleje nebo tuky přidány
I.
Úvod
1. Příprava vzorku
1.1 Všeobecně
Hmotnost vzorku dodaného laboratoři ke zkoušce je za
normálních podmínek 50 g, pokud není požadováno větší
množství.
1.2. Příprava vzorku ke zkoušce v laboratoři
Vzorek musí být před zkouškou homogenizován.
1.3. Skladovací nádoby
Takto připravený vzorek se skladuje ve vzduchotěsné
a vodotěsné nádobě.
2. Činidla
2.1. Voda
2.1.1. K rozpouštění, ředění a promývání se použije destilovaná
nebo demineralizovaná voda ekvivalentní čistoty.
2.1.2. Jestliže není při zmínce o rozpouštění nebo ředění uvedeno
žádné jiné činidlo, jde o rozpouštění nebo ředění vodou.
2.2. Chemikálie
Používají se pouze chemikálie analytické čistoty (p. a.),
pokud není uvedeno jinak.
3. Přístroje a pomůcky
3.1. Seznam přístrojů
Tento seznam obsahuje pouze položky pro speciální účel
a se specifikací.
3.2. Analytické váhy
Pojmem analytické váhy se rozumějí váhy s citlivostí 0,1
mg nebo větší.
4. Vyjádření výsledků
4.1. Výsledky
V protokolu o zkoušce se uvede střední hodnota nejméně ze
dvou stanovení s uspokojivou opakovatelností.
4.2. Výpočet procentního obsahu
Pokud není stanoveno jinak, budou výsledky vyjádřeny
v hmotnostních procentech z celkového obsahu mastných
kyselin ve vzorku přijatém laboratoří
.4.3. Počet platných desetinných míst
Počet platných desetinných míst v takto vyjádřeném
výsledku je určen přesností metody.
II.
Stanovení kyseliny erukové
1. Předmět a rozsah použití
Touto metodou se stanoví obsah kyseliny erukové
- v olejích a tucích obsahujících kyselinu cetolejovou ( Z- izomer
kyseliny dokosenové, který se vyskytuje v rybích olejích) a
- v hydrogenovaných olejích a tucích obsahujících E- a Z- izomery
kyseliny dokosenové.
2. Definice
Pojmem obsah kyseliny erukové se rozumí obsah kyseliny
erukové stanovený popsanou metodou.
3. Princip metody
Methylestery jednotlivých mastných kyselin oleje nebo tuku
se rozdělí tenkovrstvou argentační chromatografií při
nízké teplotě a kvantitativně stanoví plynovou
chromatografií s kapalnou stacionární fází.
4. Reakční činidla
4.1. Čerstvě destilovaný diethylether bez peroxidů
4.2. n-hexan
4.3. Silikagel G pro chromatografii na tenké vrstvě
4.4. Silikagel pro kolonovou chromatografii
4.5. Roztok dusičnanu stříbrného o koncentraci 200 g/l. Ve vodě
se rozpustí 24 g dusičnanu stříbrného a doplní se vodou na
120 ml.
4.6. Roztok methylesteru kyseliny erukové 5 mg/ml. V několika
ml n-hexanu se rozpustí 50 mg methylesteru kyseliny
erukové a doplní se n-hexanem do 10 ml.
4.7. Methylester kyseliny tetrakosanové jako vnitřní standardní
roztok 0,25 mg/ml.
V několika ml n-hexanu se rozpustí 25 mg methylesteru
kyseliny tetrakosanové (jako v bodě 4.6.) a doplní se
n-hexanem do 100 ml.
4.8. Vyvíjecí rozpouštědlo: toluen: n-hexan v poměru 90:10
(objemově).
4.9. Roztok 2,7-dichlorfluoresceinu o koncentraci 0,5 g/l. Za
současného zahřívání a míchání se rozpustí 50 mg
2,7-dichlorofluoresceinu ve 100 ml 50% vodného roztoku
methanolu.
5. Přístroje a pomůcky
5.1. Zařízení pro chromatografii na tenké vrstvě a dále
zejména:
5.1.1. Mrazící jednotka schopná udržet vyvíjecí komoru a její
obsah při teplotě od -20 st. C do -25 st. C.
5.1.2. Skleněné desky 200x200 mm.
5.1.3. UV lampa
5.1.4. Skleněné kolony o délce asi 200 mm o vnitřním průměru asi
10 mm s filtrem ze skelné vaty nebo s fritou, případně
malé nálevky s fritou.
5.1.5. Aplikátor pro nanášení roztoků do úzkého pásku nebo
proužku na chromatografické (TLC) desky.
5.2. Plynový chromatograf s kapalnou stacionární fází
s elektronickým integrátorem, jak je popsáno v oddílu III
přílohy VI k nařízení Komise Evropského hospodářského
společenství č. 72/77.
6. Postup
6.1. Příprava methylesterů mastných kyselin
Z přibližně 400 mg olejové nebo tukové složky zkoušeného
vzorku se připraví roztok obsahující asi 20 až 50 mg/ml
methylesterů mastných kyselin v n-hexanu metodou popsanou
v oddílu II odst. 3 přílohy VI k nařízení Komise
Evropského hospodářského společenství č. 72/77.
6.2 Chromatografie na tenké vrstvě
6.2.1. Příprava desek
Do 500 ml baňky s kulatým dnem se vsype 60 g silikagelu
(4.3.), přidá se 120 ml roztoku dusičnanu stříbrného
(4.5.) a třepe se 1 min do vytvoření zcela homogenní
suspenze. Tato suspenze se poté nanese obvyklým způsobem
na desky. Tloušťka vrstvy musí být přibližně 0,5 mm. Toto
množství suspenze je dostatečné pro přípravu pěti desek
o rozměrech 200x200 mm.
Desky se nechají částečně vyschnout na vzduchu (nejlépe
v temnu po dobu asi 30 min). Desky se úplně vysuší
a aktivují v sušárně po dobu 2,5 h při teplotě 100 st. C.
Po aktivaci se desky co nejdříve použijí nebo se
přechovávají v temnu a před použitím se znovu aktivují.
Dostačující je aktivace při 110 st. C po dobu 1 h, pokud
ovšem přitom deska neztmavne. Před použitím se v nanesené
vrstvě sorbentu vyryjí rýhy 10 mm od postranních okrajů
a od horního okraje každé desky, aby se v průběhu vyvíjení
snížily okrajové efekty.
6.2.2. Nanášení methylesterů
Aplikátorem (5.1.5.) se nanese do úzkého, asi 50 mm
dlouhého proužku, nejméně 40 mm od okraje desky a 10 mm od
spodního okraje desky 50 mikrol roztoku methylesterů
(6.1.) připravených ze vzorku. Podobným způsobem se nanese
100 mikrol směsného roztoku obsahujícího stejné objemy
připraveného roztoku methylesterů (6.1.) a roztoku
methylesteru kyseliny erukové (4.6.). Vzhledem ke
křehkosti nanesené vrstvy sorbentu se postupuje při
nanášení roztoků zvláště opatrně. Na desku lze případně
nanést také 50 mikrol roztoku methylesteru kyseliny
erukové (4.6.), který po vyvíjení pomůže při identifikaci
proužku methylesteru kyseliny erukové. Po nanesení
methylesterů se spodní okraj desky postaví do
diethyletheru na dobu, než ether dostoupí asi 5 mm nad
zónu nanesených vzorků. Tak se methylestery koncentrují
v úzkém proužku.
6.2.3. Vyvíjení desek
Do vyvíjecí komory se nalije vyvíjecí rozpouštědlo do
výšky asi 5 mm (4.8.) a komora uzavřená víčkem se uloží do
mrazící jednotky (5.1.1.) udržované při teplotě -25 st.
C nebo co nejblíže této teploty. V některých případech
může být vhodné vyvíjecí komoru obložit. Po dvou hodinách
se deska opatrně umístí do komory a rozpouštědlo se nechá
stoupat asi do jedné poloviny až dvou třetin výšky desky.
Deska se vyjme a rozpouštědlo se z ní jemně odpaří
v proudu dusíku. Deska se znovu vloží do komory
a rozpouštědlo se ponechá stoupat až k vrchnímu okraji
desky. Deska se vyjme a jako v předchozím případě se
vysuší v proudu dusíku a poté se opatrně postříká roztokem
2,7-dichlorfluoresceinu (4.9.).
Deska se prohlédne pod ultrafialovým světlem a pruh
obsahující methylester kyseliny erukové ve vzorku se určí
zvýrazněným pruhem vzorku, ke kterému byl přidán
methylester kyseliny erukové.
6.2.4. Rozdělení methylesterů
Proužek methylesteru kyseliny erukové pocházející ze
vzorku se seškrábne do 50 ml kádinky tak, aby nedošlo ke
ztrátám. Obdobně se do jiné 50 ml kádinky přenese
silikagel umístěný nad a pod proužkem methylesteru
kyseliny erukové. Tento pruh obsahuje všechny ostatní
frakce methylesterů mastných kyselin. Do každé kádinky se
přidá 1,0 ml standardního roztoku methylesteru kyseliny
tetrakosanové (4.7.) a 10 ml diethyletheru (4.1.). Obsah
kádinek se promíchá a přenese se na separační kolony či
nálevky (5.1.4.), z nichž každá obsahuje asi 1
g silikagelu (4.4.). Methylestery se extrahují třemi nebo
čtyřmi 10 ml dávkami diethyletheru a eluáty se zachycují
do malých baněk. Každý filtrát se odpaří na malý objem
v proudu dusíku a methylestery se přelijí do malých
zkumavek s kónickým dnem. Zbytek rozpouštědla se odpaří
v proudu dusíku tak, aby se methylestery zkoncentrovaly na
dně zkumavek. Methylestery se rozpustí v 25 - 50 mikrol
n-hexanu (4.2.).
6.3. Plynová chromatografie s kapalnou stacionární fází
6.3.1. Provede se postup popsaný v oddílu III přílohy VI
k nařízení Komise Evropského hospodářského společenství č.
72/77 a zkouší se 1 - 2 mikrol roztoků methylesterů
získaných z frakce obsahující methylester kyseliny erukové
a z frakcí obsahujících zbytek methylesterů mastných
kyselin.
6.3.2. Elektronickým integrátorem se stanoví následující plochy
píků:
- z chromatogramu frakce obsahující methylester kyseliny
erukové plochy píků methylesteru kyseliny erukové (E),
vnitřního standardu (L1), celkových methylesterů
s výjimkou vnitřního standardu (EF),
- z chromatogramu frakcí obsahujících zbytek methylesterů
mastných kyselin plochy píků celkových methylesterů mimo
vnitřního standardu (RF) a vnitřního standardu (L2).
7. Vyjádření výsledků
7.1. Metoda výpočtu a vzorec
7.1.1. Obsah kyseliny erukové ve vzorku vyjádřený jako procentní
podíl methylesteru kyseliny erukové z celkových
methylesterů mastných kyselin připravených ze vzorku je
dán vzorcem:
E -------------------- x 100 +-- -+ | EF RF | | -- + -- | L1| L1L2| +- --+
kde
E, EF, RF, L1 a L2 jsou plochy píků podle 6.3.2., v případě
nutnosti korigované kalibračními faktory.
Obsah methylesteru kyseliny erukové daný výše uvedeným vzorcem
odpovídá obsahu kyseliny erukové vyjádřenému v procentech
z celkového množství mastných kyselin ve vzorku.
7.1.2. Jestliže jsou plochy píků vyjádřeny v procentech, pak lze
hodnoty EF a RF vypočítat následovně:
EF = 100 - L1RF = 100 - L2
7.1.3. Metoda výpočtu podle odstavce 7.1.1. předpokládá, že
množství kyseliny tetrakosanové ve vzorku je zanedbatelné.
Jestliže se ukáže, že ve vzorku je významné množství této
kyseliny, hodnota pro kyselinu tetrakosanovou (L2) získaná
z chromatogramu frakcí obsahujících zbylé methylestery
mastných kyselin musí být snížena takto:
L2- T2kde T0P2T2= ----- P0T2je plocha píku methylesteru kyseliny tetrakosanové pocházející ze vzorku, tvořící část plochy píku vnitřního standardu v chromatogramu zbývající frakce methylesterů mastných kyselin, P2je plocha píku methylesteru kyseliny palmitové z chromatogramu zbylé frakce, T0je plocha píku methylesteru kyseliny tetrakosanové z chromatogramu methylesterů celkových mastných kyselin stanovených metodou zkoušení podle článku 2 Směrnice Komise 80/891/EHS, P0je plocha píku methylesteru kyseliny palmitové z chromatogramu methylesterů celkových mastných kyselin stanovených metodou zkoušení podle článku 2 směrnice Komise č. 80/891/EHS.
7.1.4. Odvození vzorce
Podíl mastných kyselin ve frakci obsahující methylester
kyseliny erukové vyjádřený v procentech z celkového obsahu
mastných kyselin ve vzorku je dán vzorcem:
EF ----- L1EF ------------ x 100 nebo ----------------- x 100 EF RF +- --+ ----- + --- | EF RF | L1L2L1 +----- + --- | | L1L2| +- -+ Podíl kyseliny erukové ve frakci obsahující methylester kyseliny erukové je dán vztahem: E ----- EF Odtud obsah kyseliny erukové ve vzorku vyjádřený v procentech z celkového obsahu mastných kyselin je dán vztahem: EF E E ----------------- x ---- x 100 ----------------- x 100 +- --+ EF +- --+ | EF RF | nebo | EF RF | L1+----- + --- | L1+----- + --- | | L1L2| | L1L2| +- -+ +- -+
7.1.5. Opakovatelnost
Rozdíl mezi výsledky získanými ze dvou stanovení
provedených současně nebo rychle po sobě ze stejného
vzorku stejným pracovníkem za stejných podmínek nesmí být
větší než 10 % výsledné hodnoty nebo 0,5 g na 100
g vzorku. Rozhodující je vyšší hodnota.