Odstavec předpisu 211/2004 Sb.
Vyhláška Ministerstva zemědělství č. 211/2004 Sb., o metodách zkoušení a způsobu odběru a přípravy kontrolních vzorků
Příl.7
Příl.7
Příprava vzorků a požadavky na metody zkoušení použité pro
stanovení množství dioxinů (dibenzo-1,4-dioxinů) a stanovení
polychlorovaných bifenylů s dioxinovým efektem v určitých
potravinách
1.
Cíle a oblast použití
Tyto požadavky se vztahují na zkoušení potravin pro úřední
kontrolu množství dioxinů (polychlorovaných dibenzo-1,4-dioxinů)
a polychlorovaných dibenzofuranů a stanovení polychlorovaných
bifenylů s dioxinovým efektem.
Monitorování přítomnosti dioxinů v potravinách může být založeno
na strategii využívající screeningovou metodu k vyhledání vzorků
s obsahem dioxinů o 30 až 40 % nižším nebo vyšším, než je zájmová
úroveň. Koncentrace dioxinů v těchto vzorcích s významnými
množstvími se stanoví nebo potvrdí potvrzující metodou.
Screeningové metody jsou metodami sloužícími k detekci dioxinů
a polychlorovaných bifenylů s dioxinovým efektem na zájmové
úrovni. Tyto metody mají vysokou kapacitu, pokud jde o množství
vzorků, a jsou používány k vytřídění potenciálně pozitivních
vzorků z velkého množství vzorků. Jsou speciálně vyvinuty tak, aby
neposkytovaly falešně negativní výsledky.
Potvrzující metody jsou metodami poskytujícími úplnou nebo
doplňující informaci umožňující jednoznačně kvalitativně
a kvantitativně stanovit dioxiny na zájmové úrovni.
2.
Základní informace
Vzhledem k tomu, že vzorky z životního prostření a biologické
vzorky (včetně vzorků potravin) zpravidla obsahují složitou směs
různých kongenerů dioxinů, byla pro usnadnění posuzování rizik
zavedena koncepce faktorů toxické rovnocennosti. Faktory toxické
rovnocennosti byly navrženy tak, aby vyjadřovaly koncentraci směsi
2,3,7,8-substituovaných dibenzo-1,4-dioxinů a polychlorovaných
dibenzofuranů, a od nedávné doby některých polychlorovaných
bifenylů bez atomů chloru v ortho-polohách nebo s jedním atomem
chloru v ortho-poloze, které vykazují dioxinovou aktivitu,
v toxických ekvivalentech (TEQ) 2,3,7,8-tetrachlordibezodioxinu.
Koncentrace jednotlivých látek v daném vzorku se vynásobí jejich
příslušnými faktory toxické rovnocennosti, sečtou se a výsledný
součet je celkovou koncentrací sloučenin s dioxinovým efektem
vyjádřenou v toxickém ekvivalentu.
Při metodě "horního odhadu" je velikost příspěvku kvantitativně
nestanoveného kongeneru k toxickému ekvivalentu rovna hodnotě meze
stanovitelnosti.
Při metodě "dolního odhadu" je velikost příspěvku kvantitativně
nestanoveného kongeneru k toxickému ekvivalentu rovna nule. Při
metodě "středního odhadu" je velikost příspěvku kvantitativně
nestanoveného kongeneru k toxickému ekvivalentu rovna polovině
hodnoty meze stanovitelnosti.
Pro účely této přílohy se rozumí přijatou specifickou mezí
stanovitelnosti jednotlivého kongeneru koncentrace analytu
v extraktu vzorku, který u měřicího přístroje dává pro oba dva
různé ionty, které mají být sledovány, odezvu s poměrem
signál/šum (S/N) 3:1 pro nejméně citlivý signál a splňuje základní
požadavky podle metody stanovení popsané v metodě EPA 1613
Revision B.
3.
Požadavky na zabezpečení jakosti, které musí příprava vzorku
splňovat
- Na každém stupni odběru vzorků a zkoušky musí být přijata
opatření k zamezení křížové kontaminace.
- Vzorek musí být uchováván a přepravován v nádobách ze skla,
hliníku, polypropylenu nebo polyethylenu. Z nádoby na vzorky
musí být odstraněny stopy papírového prachu. Sklo se
vypláchne rozpouštědly, jež byla předem kontrolována na
přítomnost dioxinů.
- Vzorek musí být uchováván a přepravován tak, aby byla
zachována celistvost vzorku potraviny.
- Je-li třeba, každý laboratorní vzorek se jemně rozemele
a důkladně promísí postupem, u něhož je prokázáno, že jím lze
dosáhnout úplné homogenizace (např. rozemletím a proséváním
přes 1 mm síto); je-li vlhkost vzorků příliš vysoká, musí se
vzorky před rozemletím sušit.
- Provede se slepý pokus bez vzorku za použití celého
analytického postupu.
- Hmotnost vzorku použitého pro extrakci musí být dostatečná,
aby byly splněny požadavky na citlivost stanovení.
- Existuje mnoho uspokojivých postupů přípravy vzorku, které
mohou být pro dotyčné vzorky použity. Postupy musí být
validovány podle mezinárodně uznaných metodik.
4.
Požadavky na laboratoře
- Laboratoře musí prokázat funkčnost metody v rozsahu kolem
zájmové úrovně, např. na při zájmové úrovni, při její
polovině nebo jejím dvojnásobku, a to s přijatelným variačním
koeficientem pro opakovanou zkoušku. Podrobnosti o kritériích
přijatelnosti jsou uvedeny v bodě 5.
- Mez stanovení pro potvrzující metodu by měla být na úrovni
jedné pětiny zájmové úrovně, aby se zajistilo, že na zájmové
úrovni bude dosaženo přijatelných variačních koeficientů.
- Jako opatření vnitřní kontroly jakosti by měly být prováděny
pravidelné slepé pokusy, pokusy s uměle obohacenými slepými
vzorky nebo zkoušky kontrolních vzorků (přednostně
certifikovaného referenčního materiálu).
- Úspěšná účast v mezilaboratorních srovnávacích testech, při
nichž se hodnotí odbornost laboratoře, je nejlepším způsobem
ověření odborné způsobilosti pro specifické zkoušky. Úspěšná
účast v mezilaboratorních testech, např. pro vzorky půd nebo
kalů, není nezbytně důkazem odborné způsobilosti v oblasti
potravin nebo krmiv, v nichž se vyskytují nižší úrovně
kontaminace. Proto je povinná stálá účast v mezilaboratorních
testech stanovení dioxinů a polychlorovaných bifenylů
s dioxinovým efektem v odpovídajících matricích potravin nebo
krmiv.
- V souladu s ustanovením § 9 této vyhlášky by měly být
laboratoře akreditovány pověřeným orgánem pracujícím podle
pokynů Mezinárodní normalizační organizace č. 58, aby bylo
zajištěno, že uplatňují systém zabezpečování jakosti.
Laboratoře by měly být akreditovány podle normy
ISO/IEC/17025:1999.
5.
Požadavky, které musí splňovat analytická metoda pro stanovení
dioxinů a polychlorovaných bifenylů s dioxinovým efektem
Základní požadavky na přijatelnost analytických postupů:
- Vysoká citlivost a nízká mez detekce. V případě dibenzo-1,4-
dioxinů a polychlorovaných dibenzofuranů musí být z důvodu
extrémní toxicity některých těchto sloučenin možné detekovat
množství na pikogramové úrovni toxického ekvivalentu (10-12 g).
Je známo, že se polychlorované bifenyly vyskytují ve vyšších
koncentracích než dibenzo-1,4-dioxiny a polychlorované
dibenzofurany. U většiny kongenerů polychlorovaných bifenylů je
dostačující již nanogramová citlivost na úrovni (10-9 g). Pro
stanovení toxičtějších kongenerů polychlorovaných bifenylů
s dioxinovým efektem (zejména kongenerů nesubstituovaných
chlorem v ortho-polohách) musí být dosaženo stejné citlivosti
jako pro stanovení dibenzo-1,4-dioxinů a polychlorovaných
dibenzofuranů.
- Vysoká specifičnost. Dibenzo-1,4-dioxiny, polychlorované
dibenzofurany a polychlorované bifenyly s dioxinovým efektem je
třeba rozlišit od ostatních sloučenin, které se extrahují
společně s těmito látkami, mohou rušit při jejich stanovení
a jsou přítomny v koncentracích až o několik řádů vyšších než
koncentrace zájmových analytů. U metod založených na plynové
chromatografii s detekcí hmotnostní spektrometrie je nezbytné
rozlišit mezi různými kongenery, tj. mezi toxickými kongenery
(např. sedmnácti dibenzo-1,4-dioxiny a polychlorovanými
dibenzofurany substituovanými v polohách 2,3,7,8
a polychlorovanými bifenyly s dioxinovým efektem) a ostatními
kongenery. Biotesty by měly umožnit určit hodnoty toxického
ekvivalentu selektivně pro sumu dibenzo-1,4-dioxinů,
polychlorovaných dibenzofuranů a polychlorované bifenyly
s dioxinovým efektem.
- Vysoká správnost (pravdivost a přesnost). Stanovení by mělo
poskytnout správný odhad skutečné koncentrace ve vzorku. Vysoká
správnost (správnost měření: těsnost souhlasu mezi jediným
výsledkem měření a skutečnou hodnotou nebo dohodnutou hodnotou)
je nezbytná k tomu, aby nebyl zamítnut výsledek zkoušky vzorku
na základě nespolehlivosti odhadu toxického ekvivalentu.
Správnost je vyjádřena pravdivostí (rozdílem mezi střední
hodnotou získanou měřením pro analyt v certifikovaném materiálu
a certifikovanou hodnotou vyjádřeným v procentech této
certifikované hodnoty) a přesností (přesnost se obvykle počítá
jako směrodatná odchylka včetně opakovatelnosti
a reprodukovatelnosti a vyjadřuje těsnost souhlasu mezi výsledky
získanými několikerým opakováním experimentálního postupu za
předepsaných podmínek).
Screeningovými metodami mohou být biotesty a metody založené na
založených na plynové chromatografii s detekcí hmotnostní
spektrometrie. Potvrzujícími metodami jsou metody založené na
plynové chromatografii s vysokým rozlišením s detekcí hmotnostní
spektrometrie s vysokým rozlišením. Stanovení hodnoty celkového
toxického ekvivalentu musí splňovat následující kritéria:
----------------------------------------------------------------- Screeningové metody Potvrzující metody ----------------------------------------------------------------- Podíl falešně < 1 % - negativních výsledků ----------------------------------------------------------------- Pravdivost - -20 % až +20 % ----------------------------------------------------------------- Variační koeficient < 30 % < 15 % -----------------------------------------------------------------
6.
Specifické požadavky, které musí splňovat metody založené na
plynové chromatografii s detekcí hmotnostní spektrometrie
určené pro účely screeningu nebo potvrzování
- S cílem validovat postup zkoušky musí být na samém začátku
postupu, např. před extrakcí, přidány vnitřní standardy
2,3,7,8-tetrachlor-substituovaných dibenzo- 1,4-dioxinů
a polychlorovaných dibenzofuranů značených isotopem 13C
(a standard polychlorovaných bifenylů s dioxinovým efektem
značený isotopem 13C při stanovení polychlorovaných bifenylů
s dioxinovým efektem). Musí být přidán alespoň jeden kongener
pro každou skupinu od tetra- do oktachlor dibenzo-1,4-dioxinů
a dibenzofuranů (a alespoň jeden kongener pro každou ze skupin
pro polychlorované bifenyly s dioxinovým efektem při stanovení
polychlorovaných bifenylů s dioxinovým efektem), popřípadě
k tomu alespoň jeden kongener pro každý ion detekovaný
hmotnostní spektrometrií pro monitorování dibenzo-1,4-dioxinů
a polychlorovaných dibenzofuranů a polychlorovaných bifenylů
s dioxinovým efektem. Zejména v případě potvrzující metody je
výhodou použití všech 17 vnitřních standardů 2,3,7,8-
substituovaných dibenzo-1,4-dioxinů a dibenzofuranů značených
isotopem 13C a všech 12 vnitřních standardů polychlorovaných
bifenylů s dioxinovým efektem značených isotopem 13C při
stanovení polychlorovaných bifenylů s dioxinovým efektem.
Za použití vhodných kalibračních roztoků by měly být stanoveny
také relativní odezvy kongenerů, pro něž nebyly přidány
sloučeniny značené isotopem 13C.
- U potravin rostlinného původu nebo potravin živočišného původu
s obsahem tuku nižším než 10 % je přídavek vnitřního standardu
před extrakcí povinný. U potravin živočišného původu s obsahem
tuku vyšším než 10 % lze vnitřní standard přidat buď před
extrakcí, nebo po extrakci. Vhodným způsobem by měla být
provedena validace účinnosti extrakce, a to v závislosti na
okamžiku přidání vnitřních standardů a podle toho, zda se
výsledky vztahují na výrobek nebo na obsah tuku.
- Před zkouškou plynovou chromatografií s detekcí hmotnostní
spektrometrií musí být přidán 1 nebo 2 standardy pro stanovení
výtěžnosti.
- Kontrola výtěžnosti je nezbytná. U potvrzujících metod by měly
výtěžnosti pro jednotlivé vnitřní standardy ležet v intervalu
60 % až 120 %. Nižší nebo vyšší výtěžnosti jednotlivých
kongenerů, zejména některých hepta- a okta-chlordibenzodioxinů
a dibenzofuranů jsou přijatelné za podmínky, že jejich příspěvek
k hodnotě toxického ekvivalentu nepřekračuje 10 % celkové
hodnoty toxického ekvivalentu (založené pouze na
dibenzo-1,4-dioxinech a polychlorovaných dibenzofuranech).
U screeningových metod by měly výtěžnosti ležet v intervalu od
30 % do 140 %.
- Separace dioxinů od rušících chlorovaných sloučenin, jako jsou
polychlorované bifenyly a chlorované ethery bifenylu, by měla
být provedena vhodnými chromatografickými technikami
(upřednostňují se adsorbenty florisil, oxid hlinitý nebo aktivní
uhlí).
- Rozlišení isomerů plynovou chromatografií musí být dostatečné
(poměr píků mezi 1,2,3,4,7,8-hexachlordibenzofuranem
a 1,2,3,6,7,8- hexachlordibenzofuranem - < 25 %).
- Stanovení by mělo být provedeno revidovanou metodou EPA 1613/B
nebo jinou metodou se srovnatelnými charakteristikami účinnosti.
- U potravin s úrovní kontaminace dioxiny přibližně 1 pg
toxického ekvivalentu (podle Světové zdravotnické organizace na
gram tuku - toxický ekvivalent založen pouze na dibenzo-1,4-
dioxinech a polychlorovaných dibenzofuranech) by neměl rozdíl
mezi horním odhadem a dolním odhadem překročit 20 %. U potravin
s nízkým obsahem tuku musí být při úrovni kontaminace přibližně
1 pg toxického ekvivalentu (podle Světové zdravotnické
organizace na gram produktu) dodrženy tytéž požadavky. Při
nižších úrovních kontaminace, např. 0,50 pg toxického
ekvivalentu podle Světové zdravotnické organizace na gram
produktu může být rozdíl mezi horním a dolním odhadem v rozmezí
25 až 40 %.
7.
Screeningové metody zkoušení
7.1 Úvod
Screeningové metody mohou být využity při různých přístupech
k provádění zkoušky: k čistému screeningu a ke kvantitativnímu
zkoušení.
Screeningový přístup
Odezva vzorku je porovnávána s odezvou referenčního vzorku
o zájmové úrovni. Vzorky s odezvou nižší než referenční vzorek se
prohlásí za negativní, vzorky s vyšší odezvou se považují za
pozitivní. Požadavky:
- Slepé a referenční vzorky za zařadí do každé zkoušené série,
která je extrahována a zkoušena současně a za stejných podmínek.
Referenční vzorky musí vykazovat zřetelně vyšší odezvu ve
srovnání se slepým vzorkem.
- Kromě toho se zařadí referenční vzorky o poloviční a dvojnásobné
koncentraci než je zájmová úroveň, aby se prokázalo správné
provádění zkoušky v rozsahu odpovídajícím zájmové úrovni.
- Při zkoušení jiných matric musí být prokázána vhodnost
referenčního vzorku (referenčních vzorků), a to přednostně
zařazením vzorků, u nichž byla metodou metody založené na
plynové chromatografii s vysokým rozlišením s detekcí hmotnostní
spektrometrie. Stanovením hodnoty plynovou chromatografii
s detekcí hmotnostní spektrometrií musí být prokázána hodnota
toxického ekvivalentu blízká hodnotě v referenčním vzorku, nebo
také slepého vzorku uměle obohaceného na tuto hodnotu.
- Vzhledem k tomu, že v biotestech nelze použít žádné vnitřní
standardy, jsou testy opakovatelnosti velmi důležité pro získání
informací o směrodatné odchylce v rámci zkušební série. Variační
koeficient by měl být nižší než 30 %.
- U biotestů musí být vymezeny cílové sloučeniny, možné rušivé
vlivy a nejvyšší přípustná úroveň ve slepém vzorku.
Kvantitativní zkoušení
Kvantitativní zkoušení vyžaduje sériové ředění standardního
roztoku, dvakrát nebo třikrát opakované čištění a měření a rovněž
zařazení slepých vzorků a kontroly výtěžnosti. Výsledky mohou být
vyjadřovány v toxických ekvivalentech, přičemž se vychází z toho,
že sloučeniny, jež způsobily signál, vyhovují principu toxického
ekvivalentu. To lze realizovat pomocí tetra-chlordibenzodioxinů
(nebo standardní směsi tetrachlordibenzodioxin/
tetrachlordibenzofuran), přičemž se sestrojí kalibrační křivka pro
výpočet toxického ekvivalentu extraktu a tedy i vzorku. Poté se
provede korekce na toxický ekvivalent slepého pokusu (aby se
zohlednily nečistoty v použitých rozpouštědlech a chemikáliích)
a na výtěžnost (vypočítanou z toxického ekvivalentu vzorku
určeného pro řízení jakosti s toxickým ekvivalentem na zájmové
úrovni). Je nezbytné poznamenat, že snížení výtěžnosti může být
částečně způsobeno matricovými jevy anebo rozdíly mezi hodnotami
faktorů toxické rovnocennosti v biotestech a oficiálními hodnotami
faktorů toxické rovnocennosti podle Světové zdravotnické
organizace.
7.2 Požadavky na metody zkoušení použité pro screening
- Pro screening mohou být použity metody založené na plynové
chromatografii s detekcí hmotnostní spektrometrií a biotesty.
U metod založených na plynové chromatografii s detekcí
hmotnostní spektrometrií platí požadavky uvedené v bodě 6.
Specifické požadavky na biotesty na buňkách jsou uvedeny v bodě
7.3 a požadavky na biotesty se sadami jsou uvedeny v bodě 7.4.
- Je nezbytné uvést, jaký je počet falešně pozitivních a falešně
negativních výsledků ve velkých sadách vzorků s hodnotami
ležícími nad a pod maximálním limitem nebo zásahovou úrovní ve
srovnání s výsledky toxického ekvivalentu získanými
potvrzujícími metodami zkoušení. Skutečný podíl falešně
negativních výsledků by měl být nižší než 1 %. Podíl falešně
pozitivních výsledků by měl být dostatečně nízký, aby bylo
použití screeningu výhodné.
- Pozitivní výsledky musí být vždy potvrzeny potvrzující metodou
zkoušení založenou na plynové chromatografii s vysokým
rozlišením s detekcí hmotnostní spektrometrií s vysokým
rozlišením. Kromě toho musí být potvrzující metodou založenou na
plynové chromatografii s detekcí hmotnostní spektrometrií
s vysokým rozlišením potvrzeny výsledky u vzorků s širokým
rozmezím hodnot toxického ekvivalentu (přibližně 2 % až 10 %
negativních vzorků). Měly by být k dispozici informace o shodě
výsledků biotestů a metod založených na plynové chromatografii
s vysokým rozlišením s detekcí hmotnostní spektrometrií
s vysokým rozlišením.
7.3
Specifické požadavky na biotesty na buňkách
- Při provádění biotestu je nezbytné použít pro každý test sérii
referenčních koncentrací tetra-chlordibenzodioxinů nebo směsi
tetrachlordibenzodioxin/ tetrachlordibenzofuran (celá křivka
závislosti odezvy na dávce s r2 > 0,95). Pro účely screeningu
však může být ke zkoušení vzorků s nízkými hodnotami použita
křivka prodloužená do oblasti nízkých hodnot.
- Pro vyjadřování výsledků biotestů v rámci konstantního časového
období může být použita referenční koncentrace
tetrachlordibenzodioxinů (asi 3krát vyšší než mez stanovení)
uvedená v protokolu řízení jakosti. Alternativou by mohla být
relativní odezva referenčního vzorku vzhledem ke kalibrační
křivce tetra-chlordibenzodioxinů, neboť odezva buněk může
záviset na mnoha faktorech.
- Pro každý typ referenčního materiálu by měly být zaznamenávány
a ověřovány grafy řízení jakosti, aby se zajistilo, že výsledky
jsou v souladu se stanovenými pokyny.
- Zejména při kvantitativních výpočtech musí být použito takové
ředění vzorku, aby leželo v lineárním úseku křivky závislosti
odezvy. Vzorky ležící nad lineárním úsekem křivky závislosti
odezvy se musí zředit a znovu zkoušet. Doporučuje se tedy, aby
byly současně zkoušeny alespoň tři nebo více stupňů ředění.
- Směrodatná odchylka vyjádřená v procentech nesmí být při třech
stanoveních pro žádný stupeň ředění vyšší než 15 % a pro tři
nezávislé experimenty nesmí být vyšší než 30 %.
- Mez detekce může být stanovena na úrovni trojnásobku směrodatné
odchylky slepého vzorku rozpouštědla nebo odezvy pozadí. Jinou
možností je použít odezvu, která leží nad odezvou pozadí
vypočtenou z kalibrační křivky sestrojené v daný den (indukční
faktor pětinásobek odezvy slepého vzorku rozpouštědla). Mez
stanovení může být stanovena na úrovni pěti- až šestinásobku
směrodatné odchylky odezvy slepého vzorku rozpouštědla nebo
pozadí, nebo se použije odezva, která je nad odezvou pozadí
vypočtenou z kalibrační křivky sestrojené v daný den (indukční
faktor desetinásobek odezvy slepého vzorku rozpouštědla).
7.4
Specifické požadavky na sady biotestů
- Při přípravě vzorku a při zkouškách musí být dodrženy pokyny
výrobce.
- Testovací sady nesmí být použity po datu použitelnosti.
- Neměly by se používat materiály nebo součásti určené pro použití
s jinou sadou.
- Testovací sady by měly být uchovávány při daných skladovacích
teplotách a měly by být používány při předepsané pracovní
teplotě.
- Mez detekce imunotestů se stanoví jako podíl hodnoty odezvy
trojnásobku směrodatné odchylky odezvy deseti opakovaných
stanovení provedených se slepým vzorkem a hodnoty směrnice
přímky získané lineární regresí.
- Pro kontrolu, zda odezva leží v přijatelném rozsahu, by měly při
laboratorních testech použity referenční standardy.
8.
Oznamování výsledků
Pokud to analytický postup umožňuje, měly by analytické výsledky
obsahovat hodnoty pro jednotlivé kongenery dibenzo-1,4-dioxinů
a dibenzofuranů a polychlorovaných bifenylů a mělo by být uvedeno,
zda jde o horní, dolní nebo střední odhad, aby bylo ve zprávě
o výsledcích uvedeno maximální množství informací a bylo tím
umožněno interpretovat výsledky podle specifických požadavků. Ve
zprávě by měl být také uveden obsah lipidů ve vzorku a metoda
extrakce lipidů.
Jestliže výtěžnost leží mimo rozmezí uvedené v bodě 6, nebo je-li
překročen maximální limit, a dále na požádání, musí být
k dispozici výtěžnost pro jednotlivé vnitřní standardy.