Odstavec předpisu 299/2003 Sb.
Vyhláška Ministerstva zemědělství č. 299/2003 Sb., o opatřeních pro předcházení a zdolávání nákaz a nemocí přenosných ze zvířat na člověka
Příl.20
Příloha 20
TUBERKULÓZA
1. IDENTIFIKACE PŮVODCE
Přítomnost Mycobacterium bovis (dále jen "M. bovis"), původce tuberkulózy
skotu, v klinických a pitevních vzorcích lze prokázat vyšetřením obarvených nátěrů
nebo imunoperoxidázovými technikami a potvrdit kultivací mikroorganismu na primární
izolační půdě.
Pitevní materiál pro potvrzení M. bovis by se měl odebírat z patomorfologicky
změněných mízních uzlin a parenchymatózních orgánů jako jsou plíce, játra, slezina,
atd. Nevykazuje-li zvíře patomorfologické změny, vzorky k vyšetření a kultivaci by
se měly brát ze zahltanových mízních uzlin, z mízních uzlin průdušnico-průduškových,
meziplicních, povrchových tříselných, tj. nadvemenních, mízních uzlin spodní čelisti
a některých okružních mízních uzlin a jater.
Určování izolovaných mykobakterií může být obvykle prováděno zjišťováním
kultivačních a biochemických vlastností. Lze také použít polymerázovou řetězovou
reakci (PCR) k detekci komplexu M. tuberculosis. Metody analýzy DNA mohou být rychlejší
a spolehlivější než biochemické metody pro odlišení M. bovis od ostatních členů komplexu
M. tuberculosis. Genetické stopy umožňují rozlišování různých kmenů M. bovis a popsání
vzorců původu, přenosu a rozšíření M. bovis.
Použité metody a půdy, jejich standardizace a vyhodnocení výsledků musí vyhovovat
Příručce norem pro vyšetřovací metody a očkovací látky OIE, čtvrtému vydání, 2000,
kapitole 2.3.3. (tuberkulóza skotu).
2. INTRADERMÁLNÍ TUBERKULINACE
Tuberkulín purifikovaný proteinový derivát (dále jen "tuberkulín PDD"), bovinní
nebo aviární, který splňuje normy stanovené v odstavci 2.1, se používá k provádění
úředně stanovené intradermální tuberkulinace, a to podle postupů uvedených v odstavci
2.2.
2.1 Normy pro bovinní a aviární tuberkulín
2.1.1 Definice
Tuberkulín PPD, bovinní nebo aviární, je preparát získaný
z teplem ošetřených produktů růstu a rozkladu Mycobacterium bovis nebo Mycobacterium
avium (podle potřeby), které jsou schopny odhalit pozdní alergickou reakci u zvířete
senzibilizovaného k mikroorganismům stejného druhu.
2.1.2 Výroba
Získává se z frakcí rozpustných ve vodě, připravených záhřevem
ve volně proudící páře a následně filtrováním kultur M. bovis nebo M. avium (podle
potřeby) vyrostlých v tekuté syntetické půdě. Aktivní frakce filtrátu, skládající
se hlavně z proteinu, se izoluje srážením, promyje se a znovu rozpustí. Může se přidat
antimikrobiální konzervační prostředek, který nezpůsobuje falešné pozitivní reakce,
jako je fenol. Konečný sterilní preparát, prostý mykobakterií, se asepticky přenese
do sterilních kontejnerů ze skla odolného proti poškození, které se poté uzavřou
tak, aby se zabránilo kontaminaci. Přípravek lze lyofilizovat.
2.1.3 Zkouška výrobku
Injekčně se aplikují řady po sobě jdoucích ředění intradermálně
na různá místa přiměřeně senzibilizovaným morčatům albínům, z nichž každé váží nejméně
250 g. Po 24 až 28 hodinách se objeví reakce ve formě edémů se zarudnutím kůže, též
s nekrózou nebo bez nekrózy v místech vpichu. Velikost a síla reakcí jsou různé podle
dávky. Nesenzibilizovaná morčata nevykazují na podobné aplikace žádné reakce.
2.1.4 Testování
2.1.4.1 pH:pH je 6,5 až 7,5.
2.1.4.2 Fenol: Jestliže preparát k vyšetření obsahuje fenol, jeho koncentrace
není vyšší než 5 g/l.
2.1.4.3 Senzibilizační účinek: použije se skupina tří morčat, která nebyla
ošetřena žádným materiálem, jenž by zkresloval výsledky vyšetření. Třikrát v intervalech
pěti dní se injekčně intradermálně aplikuje každému morčeti dávka testovaného preparátu,
která odpovídá 500 MJ v 0,1 ml. 15 až 21 dní po třetí injekci se aplikuje stejná
dávka, tj. 500 MJ, intradermálně těmto zvířatům a kontrolní skupině tří morčat stejné
hmotnosti, která předtím nedostávala injekce tuberkulínu. Za 24 až 28 hodin po posledních
aplikacích by se reakce těchto dvou skupin neměly nijak významně lišit.
2.1.4.4 Toxicita: použijí se dvě morčata, z nichž každé váží alespoň 250
g, kterým nebyl podán žádný materiál, jenž by zkresloval výsledky vyšetření. Podkožně
se každému morčeti aplikuje 0,5 ml testovaného preparátu. Zvířata se sledují po dobu
sedmi dnů. Během doby sledování by se neměly vyskytnout žádné abnormální účinky.
2.1.4.5 Sterilita: shoduje se s testem sterility, který je předepsaný v
monografii o Očkovacích látkách k veterinárnímu použití, 4. vydání Evropského lékopisu
2002.
2.1.5 Účinnost
Účinnost tuberkulínu PPD, bovinního nebo aviárního, se určuje
srovnáním reakcí senzibilizovaných morčat po intradermálních injekcích řady roztoků
testovaného preparátu s reakcemi vzniklými na základě podání známých koncentrací
referenčního preparátu tuberkulínu PPD, bovinního nebo aviárního (podle potřeby),
kalibrovaného v mezinárodních jednotkách.
Za účelem testování účinnosti se senzibilizuje
alespoň devět morčat albínů, z nichž každé váží 400 až 600 g, a to intramuskulární
injekcí 0,0001 mg vlhké hmoty živého kmene M. bovis AN5 rozptýleného v 0,5 ml 9 g/l
roztoku chloridu sodného R u bovinního tuberkulínu nebo přiměřenou dávkou inaktivovaného
nebo živého M. avium u aviárního tuberkulínu hluboko do svalu. Nejdříve za čtyři
týdny po senzibilizování morčat se jejich boky oholí, aby bylo připraveno místo pro
maximálně čtyři místa vpichu na každé straně. Připraví se ředění testovaného preparátu
a referenčního preparátu v izotonickém fyziologickém roztoku ve fosfátovém pufru
(pH 6,5- 7,5) s obsahem 0,005 g/l polysorbátu 80 R. Použijí se minimálně tři dávky
referenčního preparátu a minimálně tři dávky testovaného preparátu. Dávky se zvolí
tak, aby vzniklé změny měly v průměru alespoň 8 mm a maximálně 25 mm. Ředění se rozdělí
nahodile na místa s použitím latinského čtvercového rozdělení. Každá dávka se vstříkne
intradermálně ve stálém objemu 0,1 až 0,2 ml. Průměry změn se změří po 24 až 28 hodinách
a vypočítá se výsledek testu za použití obvyklých statistických metod a za předpokladu,
že průměry změn jsou přímo úměrné logaritmu koncentrace tuberkulínů.
Test je platný
pouze pokud předpokládané limity chyby (P = 0,95) jsou v rozmezí 50 % až 200 % odhadované
účinnosti. U bovinního tuberkulínu by odhadovaná účinnost neměla být menší než 66
% a větší než 150 % stanovené účinnosti. U aviárního tuberkulínu by odhadovaná účinnost
neměla být menší než 75 % a větší než 133 % stanovené účinnosti. U obou tuberkulínů,
bovinního i aviárního, by stanovená účinnost by neměla být menší než 20000 MJ/ml.
2.1.6 Skladování
Skladujte při teplotě 5 +/- 3 °C a chraňte před světlem.
2.1.7 Označování
Označení uvádí:
- účinnost v mezinárodních jednotkách na
mililitr,
- název a množství všech přidaných látek,
- u lyofilizovaných přípravků:
- název a objem rozpouštědla, které se má přidat,
- že výrobek má být použit ihned
po rozpuštění.
2.2 Vyšetřovací metody
2.2.1 Za úředně stanovené intradermální tuberkulinace se uznávají:
- jednoduchá
intradermální tuberkulinace: toto vyšetření vyžaduje jednu aplikaci bovinního tuberkulínu,
-
simultánní intradermální tuberkulinace: toto vyšetření vyžaduje jednu intradermální
injekci bovinního tuberkulínu a jednu intradermální injekci aviárního tuberkulínu,
které jsou podávány současně.
2.2.2 Dávky injekčně podaného tuberkulínu:
- nejméně 2000 MJ bovinního tuberkulínu,
-
nejméně 2000 MJ aviárního tuberkulínu.
2.2.3 Objem každé injekčně podané dávky nepřesahuje 0,2 ml.
2.2.4 Tuberkulinace se provádí injekcemi tuberkulínu(ů) do kůže na krku.
Místa vpichů se nacházejí na hranici předních a středních třetin krku. Pokud se aviární
a bovinní tuberkulíny podávají témuž zvířeti, místo pro injekce aviárních tuberkulínů
se nachází asi 10 cm od nejvyššího bodu krku a místo pro injekce bovinního tuberkulínu
je asi o 12,5 cm níže na čáře, která je přibližně rovnoběžná s linií plece nebo na
různých stranách krku; u mláďat, kde není místo k tomu, aby se místa na jedné straně
krku dostatečně oddělila, se provede injekce na každé straně krku ve stejných místech
ve středu střední třetiny krku.
2.2.5 Tuberkulinace a vyhodnocení reakcí se provádí takto:
2.2.5.1 Postup:
Místa vpichu se ostříhají a očistí. Kožní řasa v každé
ostříhané oblasti se uchopí mezi ukazováčkem a palcem, změří se posuvným měřítkem
a zaznamená se. Poté se injekčně aplikuje dávka tuberkulínu postupem, který zajistí,
aby byl tuberkulín vpraven intradermálně. Lze použít krátkou sterilní jehlu, jejíž
zkosená hrana směřuje ven, s kalibrovanou injekční stříkačkou naplněnou tuberkulínem,
která se šikmo vpíchne do hlubších vrstev kůže. Správná aplikace se potvrdí nahmatáním
zduření ve tvaru hrášku v každém místě vpichu. Tloušťka kožní řasy v každém místě
vpichu se opětovně změří po 72 hodinách (+- 4 hodiny) po injekci a zaznamená se.
2.2.5.2 Vyhodnocení reakcí Vyhodnocení reakcí se zakládá na klinických
sledováních a zaznamenaném zvýšení tloušťky kožní řasy v místech vpichu za 72 hodin
po injekcích tuberkulínu(ů).
a) Negativní reakce: pokud je pozorováno pouze omezené
zduření se zvýšením tloušťky kožní řasy nejvýše 2 mm, bez klinických příznaků, jako
je difúzní nebo rozsáhlý otok, výpotek, nekróza, bolestivost nebo zánět mízních cév
v této oblasti nebo mízních uzlin.
b) Dubiózní reakce: jestliže nejsou nalezeny žádné
klinické příznaky uvedené v písmenu a) a jestliže je zvýšení tloušťky kožní řasy
větší než 2 mm a menší než 4 mm.
c) Pozitivní reakce: jestliže jsou nalezeny klinické
známky uvedené v písmenu a) a jestliže je tloušťka kožní řasy v místě vpichu vyšší
o 4 mm nebo více.
2.2.5.3 Vyhodnocení úředně stanovené intradermální tuberkulinace:
2.2.5.3.1
Jednoduchá intradermální tuberkulinace:
a) Pozitivní: pozitivní reakce skotu, jak
je definována v odst. 2.2.5.2 písm. c);
b) Dubiózní: dubiózní reakce, jak je definována
v odst. 2.2.5.2 písm. b);
c) Negativní: negativní reakce skotu, jak je definována
v odst. 2.2.5.2 písm. a);
Zvířata, u nichž je jednoduchá intradermální tuberkulinace
dubiózní, jsou vyšetřena další intradermální tuberkulinací nejméně po 42 dnech.
Zvířata,
která nejsou v tomto druhém testu negativní, jsou v tomto testu považována za pozitivní.
Pokud
existuje podezření z falešné pozitivní reakce nebo zkreslené reakce, lze zvířata,
u nichž je jednoduchá intradermální tuberkulinace pozitivní, vyšetřit simultánní
intradermální tuberkulinací.
2.2.5.3.2 Simultánní intradermální tuberkulinace pro stanovení a zachování
statutu stáda úředně prostého tuberkulózy:
a) Pozitivní: pozitivní reakce na bovinní
tuberkulin, která je o více než 4 mm větší než reakce na aviární tuberkulín, nebo
přítomnost klinických příznaků;
b) Dubiózní: pozitivní nebo dubiózní reakce na bovinní
tuberkulin, která je o 1 až 4 mm větší než reakce na aviární tuberkulín, a nepřítomnost
klinických příznaků;
c) Negativní: negativní reakce na bovinní tuberkulin nebo pozitivní
nebo dubiózní reakce na bovinní tuberkulin, která se rovná nebo je menší než pozitivní
nebo dubiózní reakce na aviární tuberkulín, a v obou případech nepřítomnost klinických
příznaků.
Zvířata, u nichž je simultánní intradermální tuberkulinace dubiózní, jsou
vyšetřena další intradermální tuberkulinací nejméně po 42 dnech. Zvířata, která nejsou
v tomto druhém testu negativní, jsou v tomto testu považována za pozitivní.
2.2.5.3.3 Statut stáda úředně prostého tuberkulózy lze dočasně pozastavit
a obchodování uvnitř Společenství se zvířaty ze stáda není povoleno do doby, než
se vyřeší statut těchto zvířat:
a) zvířat, u nichž byla jednoduchá intradermální
tuberkulinace považována za dubiózní;
b) zvířat, u nichž byla jednoduchá intradermální
tuberkulinace považována za pozitivní, ale mají být opětovně vyšetřena simultánní
intradermální tuberkulinací;
c) zvířat, u nichž byla simultánní intradermální tuberkulinace
považována za dubiózní.
2.2.5.3.4 Pokud právní předpisy Společenství vyžadují, aby byla zvířata
vyšetřena intradermální tuberkulinací před přesunem, výsledek vyšetření se vyhodnotí
tak, že se nepovolí obchodování uvnitř Společenství se žádným zvířetem, které vykazuje
zvýšení tloušťky kožní řasy o více než 2 mm nebo které vykazuje klinické příznaky.
2.2.5.3.5 Státní veterinární správa může za účelem umožnění zjištění co
nejvyššího počtu nakažených a nemocných zvířat ve stádě nebo v regionu upravit kritéria
pro hodnocení výsledků vyšetření tak, aby se dosáhlo zvýšení jeho citlivosti, přičemž
se všechny dubiózní reakce uvedené v odst. 2.2.5.3.1 písm. b) a v odst. 2.2.5.3.2
písm. b) považují za pozitivní.
3. DOPLŇKOVÉ TESTY
Státní veterinární správa může kromě tuberkulinace za účelem umožnění zjištění
co nejvyššího počtu nakažených a nemocných zvířat ve stádě nebo v regionu schválit
použití testu na interferon gama uvedeného v Příručce norem pro vyšetřovací metody
a očkovací látky OIE, 4. vydání, 2000, kapitola 2.3.3 (bovinní tuberkulóza).